Dijeljenje članaka丨A-poboljšana CRISPR-Cas14a mikrofluidna platforma za precizno-detekciju geminivirusa na licu mjesta u biljkama paradajza i bijelim mušicama

Geminivirusi predstavljaju ozbiljnu prijetnju globalnoj proizvodnji paradajza kroz brzu evoluciju i prijenos putem bijele mušice širom svijeta. Trenutne metode detekcije prvenstveno ciljaju simptomatske biljke, često dajući dijagnostičke rezultate tek nakon što virusno opterećenje dostigne prenosive razine, čineći kontrolu bolesti neučinkovitom. Rana intervencija ovisi o identifikaciji infekcija prije pojave simptoma-ili čak otkrivanju prisustva virusa u vektorima insekata prije nego što prenesu viruse na biljke. Dok nedavni napredak u izotermnoj amplifikaciji i dijagnostici zasnovanoj na CRISPR-u nudi potencijalna rješenja, praktična implementacija se suočava sa inherentnim ograničenjima: nekompatibilnost između enzimske amplifikacije i CRISPR sistema, rizici od kontaminacije iz višestepenih procedura i neadekvatna prilagodljivost uređaja za detekciju na terenu. Da bismo odgovorili na ove izazove, razvili smo MaC14a-mikrofluidnu platformu poboljšanu AI- koja integriše asimetrično multienzimsko izotermno brzo pojačanje (aMIRA) sa CRISPR-Cas14a. Ovaj sistem prevazilazi ključne tehničke barijere optimizirajući stehiometriju prajmera za generiranje ssDNA za PAM-nezavisnu Cas14a aktivaciju, postižući ultraosjetljivu detekciju (10 fM) uz eliminaciju unakrsne-kontaminacije putem jedne-reakcije. Zajedno sa centrifugalnim mikrofluidnim čipom, prijenosnom optičkom detekcijom i interpretacijom signala zasnovanom na mašinskom učenju, MaC14a omogućava multipleksirano otkrivanje četiri geminivirusa u roku od 5 minuta, pokazujući 100% dijagnostičku tačnost za uzorke biljaka i bijelih mušica. Njegovi proboji uključuju: (i) detekciju presimptomatske infekcije u biljkama i (ii) precizno određivanje prijenosa virusa kod pojedinačnih bijelih mušica-popunjavajući kritičnu tehnološku prazninu u pre-nadzoru prije prijenosa. Osim pružanja novog alata za upravljanje geminivirusima, ova studija uspostavlja paradigmu "AI-CRISPR-mikrofluidike" za zaštitu usjeva. Prebacivanjem fokusa sa simptomatskih biljaka na viruliferne vektore i asimptomatske infekcije, ova tehnologija nudi transformativno rješenje za prekid ciklusa prijenosa virusa na njihovom izvoru.

Integrisani radni tok MaC14a sistema za multipleks nadzor geminivirusa.

(A) Mehanizam detekcije nukleinske kiseline posredovane aMIRA-Cas14a-. Šema koja ilustruje aMIRA-pokrenutu ssDNK amplifikaciju zajedno sa Cas14a PAM nezavisnim prepoznavanjem ssDNK i aktivnošću kolateralnog cijepanja, omogućavajući detekciju jedne-epruvete (kompatibilno sa-fluorescentnim PCR instrumentima u stvarnom vremenu) ili na{8vidica{9} analizi na lokaciji centrifugalni uređaji za detekciju). (B) Mikrofluidna detekcija (MaC14a) radni tok za terensku{12}}upotrebnu dijagnostiku. Vremenski koraci su označeni strelicama, pokazujući trajanje svakog procesa unutar prijenosnog analizatora. (C) Dijagram toka-algoritma detekcije u stvarnom vremenu zasnovanog na mrežama dugotrajne{16}}mreže (LSTM). Optimizovani algoritam olakšava obradu fluorescentnih signala-u realnom vremenu, omogućavajući interpretaciju rezultata u roku od 5-10 minuta.

Sistem za detekciju aMIRA-Cas14a

(A) Šematski dijagram ilustruje mehanizam reakcije platforme za detekciju aMIRA-Cas14a. (B) Specifična aktivnost cijepanja Cas14a na aMIRA proizvodima je verificirana analizom gel elektroforeze (C) Komparativna analiza metoda detekcije aMIRA u jednom{4}}i dva-stepena aMIRA-Cas14a metoda. Napomena: U protokolu reakcije u dva{9}}koraka, proces počinje sa 20-minutnim pojačavanjem aMIR-a, nakon čega slijedi dodavanje sistema za detekciju Cas14a za praćenje fluorescencije. Shodno tome, prikupljanje fluorescentnih signala počinje u vremenskoj tački od 20 minuta. (D) i (E) Eksperimenti optimizacije su provedeni kako bi se odredili optimalni omjeri prajmera naprijed i nazad. (F–I) Specifičnost sistema aMIRA-Cas14a potvrđena je detekcijom četiri različite virusne mete (TYLCCNV, TYLCV, TOLCNDV i TbCSV) u biljnim uzorcima. Mešani uzorak (označen kao Mix) je pripremljen kombinovanjem jednakih zapremina svakog preparata virusne DNK.

Da bismo postigli pojačanje signala za količine virusnih nukleinskih kiselina u tragovima i obezbijedili dovoljno supstrata za Cas14a, razvili smo aMIRA (asimetrična multienzimska izotermna brza amplifikacija) zasnovana na MIRA-i. Rezultirajući aMIRA-Cas14a sistem nudi sljedeće ključne prednosti:

1. Optimizirana stehiometrija prajmera omogućava MIRA-i da preferencijalno prekomjerno proizvodi ssDNA, koja služi kao direktan supstrat za Cas14a. Podešavanjem omjera prajmera-na-obrnuti na 20:1, sistem generiše dovoljno ssDNK da aktivira PAM-nezavisnu aktivnost cijepanja Cas14a, koja specifično prepoznaje i cijepa ssDNK.
2. Integracija MIRA i CRISPR-Cas14a u jednom loncu eliminiše rizike od unakrsne kontaminacije.
3. MIRA značajno povećava osjetljivost detekcije, omogućavajući detekciju virusnih nukleinskih kiselina s ultra-niskim udjelom.
4. aMIRA-Cas14a održava visoku specifičnost, izbjegavajući lažne pozitivne rezultate uzrokovane nespecifičnim pojačavanjem.

Na kraju, integracija MIRA-e i CRISPR-Cas14a u jednom loncu eliminiše rizike od kontaminacije i postiže savršenu sinergiju između MIRA-ine prednosti i CRISPR-Cas14a sistema. Ovo rješava industrijski izazov nekompatibilnosti između izotermnog pojačanja i CRISPR sistema, što predstavlja osnovni tehnološki proboj MaC14a platforme. Sistem aMIRA-Cas14a postiže 1.000 puta poboljšanje u osjetljivosti uz osiguranje specifičnog pojačanja. U kombinaciji sa prepoznavanjem Cas14a specifičnim za sekvencu, ovo obezbjeđuje dvoslojnu validaciju specifičnosti, bez unakrsne reaktivnosti na neciljne viruse ili zdrave uzorke-koja rješava još jednu bolnu tačku industrije: tendenciju lažno pozitivnih rezultata.

Multienzimske izotermne reagense za brzo pojačanje MIRA korišćene u ovoj studiji obezbedio je Amp-Future (Changzhou) Biotech Co., Ltd. Osim odličnih performansi reagensa, Amp-future Biotech takođe nudi profesionalan tim za tehničku podršku koji brzo reaguje.

MIRA pokazuje snažnu kompatibilnost sa mikrofluidnim čipovima baziranim na centrifugi-razvijenim za istraživačke i dijagnostičke aplikacije:

1.Minijaturizirani reakcioni sistem, pogodan za mikro-reakcione komore karakteristične za mikrofluidne čipove;
2. Mogućnost detekcije multipleksa u jednom pokretanju;
3.Kompatibilnost s prijenosnim uređajima, glatki tijek rada od uzorka do rezultata.

Prenosivi analizator i arhitektura čipa.

(A) Eksplodirani prikaz prijenosnog uređaja za detekciju, koji pokazuje glavne komponente. (B) Modularna arhitektura centrifugalnog mikrofluidnog čipa. (C) Kontrola fluida vođena centrifugiranjem. Analiza putanja transporta tekućine pod programabilnim centrifugalnim silama.

dizajnirali smo integrisani prenosivi uređaj za "uzor-ulaz, odgovor-izlaz"-za-testiranje (POCT) uređaj optimiziran za primenu na terenu, kao što je ilustrovano na slici. 4A. Kompaktni prototip (23 cm (D) × 21 cm (Š) × 14 cm (V), 12,5 kg ukupne mase) postiže izuzetnu prenosivost. Osnovne komponente sistema uključuju visoko{11}}precizni servo motor za preciznu kontrolu rotacije i jedinicu za grijanje zraka za regulaciju temperature. Integrirani optički modul za detekciju, smješten ispod čipa, olakšava pobudu i mjerenje fluorescencije, osiguravajući visoku osjetljivost i tačnost u detekciji. Prijenosni uređaj je opremljen sa ugrađenim Android operativnim sistemom, koji nudi korisnički-prijateljski interfejs gdje operateri mogu odabrati unaprijed programirane operativne fajlove koji sadrže detaljne parametre kao što su vrijeme reakcije i temperatura. Rezultati i zaključci se prikazuju u realnom vremenu-na LCD ekranu, omogućavajući brzo prikupljanje informacija. Dodatno, sistem uključuje bežični komunikacioni modul koji podržava-prenos podataka u realnom vremenu na mobilne uređaje ili servere u oblaku, integrirajući se s algoritmima umjetne inteligencije za trenutnu interpretaciju i analizu rezultata testa.

news-800-847

Da bismo procijenili kapacitet MaC14a sistema za otkrivanje prijenosa virusa u vektorima insekata, sproveli smo testove akvizicije TYLCV koristeći

Bemisia tabaci populacije. Bijelim mušicama je dozvoljen 3-dnevni period sticanja hranjenja na biljkama zaraženim TYLCV, a zatim su obrađene kroz

MaC14a sistem (slika D). Naknadna analiza je otkrila da je 8 od 10 testiranih bijelih mušica (80%) pokazalo pozitivne virusne signale (slika E). Važno je da su svi uzorci iz negativne kontrolne kohorte (hranjeni isključivo zdravim biljkama) zadržali osnovne nivoe fluorescencije. Ovi rezultati pokazuju da sistem MaC14a može precizno identificirati svoj potencijalni bijeli virus na visokom nivou{10} za praćenje i kontrolu prenosa virusa u poljoprivrednim okruženjima.

U naknadnom eksperimentu dvostruke-slijepe validacije, testirali smo 20 uzoraka listova paradajza (S1–S20) prikupljenih iz dvije zone uzgoja u stakleniku u Hangzhouu, provincija Zhejiang, Kina, i dva staklenikazone uzgoja u Nanningu, provincija Guangxi, Kina. Svaka zonadao pet uzoraka listova paradajza koji pokazuju tipične simptome virusainfekcija (kao što je hloroza, mozaičke mrlje i uvijanje listova) i petbijele mušice (ukupno 20). AI-poboljšani MaC14a sistem isporučen je rerezultate u 5. minuti, koji su u potpunosti odgovarali dobijenimsa 60-minutnog aMIRA-Cas14a testa i qPCR platforme, demonstrirajući100 % saglasnost (sl. F, S6-S7, tabela S3). Osim toga, virusvrste otkrivene u biljnim uzorcima bile su vrlo konzistentne s njimaidentifikovani u vektorskim insektima iz iste zone uzgoja. Overezultati ističu značajan potencijal AI-poboljšanog MaC14a na-dijagnostika biljnih virusa na lokaciji, postižući veliku brzinu (od nukleinske kiselineekstrakcija za rezultat očitavanja za samo 10 minuta), visoka preciznost (dosljednasa qPCR rezultatima) i prenosivost.

Dijeljenje članaka丨A-poboljšana CRISPR-Cas14a mikrofluidna platforma za precizno-detekciju Geminivirusa u biljkama paradajza i bijelim mušicama