"Razvoj romana CAS13A / CAS12A-posredovano"Jedan lonac" dvostruki Testa za otkrivanje za genetski modificirane kulture Express
Genetski modificirani usjevi široko su posađeni širom svijeta, a mnoge su zemlje postepeno poboljšale svoje regulatorne mjere kako bi se osigurala sigurnost genetski modificiranih usjeva. Razvoj brzog i točne metode genetskog otkrivanja na licu mjesta vrlo je važan za poljoprivredu i biološku sigurnost i može ublažiti zabrinutost za javnost o genetski modificiranim proizvodima.
U ovoj studiji je istraživačkoj grupi razvila novu reakciju s jednom lonjom -- Mira dvostruko otkrivanje u kombinaciji s dualnim CrisPR-om (MR-DCA metodom) za istodobno otkrivanje CAMV35-a i genetskih ciljeva u genetski modificiranim usjevima, pružajući jednostavnu i efikasnu metodu otkrivanja za otkrivanje genetski modificiranih usjeva.
Eksperimentalne metode
Dvostruki proizvod Mira analizira CAS13A i CAS12A dual sistem za generiranje dva neovisna signala koja se ne ometaju jedna na drugu, a zatim se fluorescentna boja čita instrumentom osvjetljenja ili testnim trakom za postizanje dvostrukog ottaranja. Čitav proces je završen za manje od 35 minuta, sa ograničenjem otkrivanja čak 20 primjeraka.
(Princip otkrivanja g-dca CAMV35S i br.)
Čitav eksperiment podijeljen je u tri koraka: Mira pojačala, CrisPr reakcija i dvije metode interpretacije rezultata.
GENE GENAKS3 koristi se kao cilj CAS13A, a br. Gen koristi se kao cilj CAS12A. Dizajnirani su dva para temeljnika Mira. CAS13A sistem prepoznaje samo RNA, pa je dizajniran region prema naprijed, koji sadrži promotor T7 za naknadnu transkripciju i aktiviranje CAS13A. Pam se dodaje u nos gene. Gore navedene dodatke osiguravaju da se i proteini CAS13A i CAS12A mogu vezati za njihove vrste Crrnas, a ne postoji smetnja ili unakrsna reakcija između dva sistema.
Eksperimentalna situacija
Osjetljivost i specifičnost
Uzorak je razblažen u gradijent za testiranje intenziteta fluorescencije Mira reakcije. Otkriveno je da se intenzitet fluorescencije i dalje može otkriti u koncentraciji uzorka od 20 μl. Koncentracija od 20 μl konačno je odabrana za eksperiment.
(Različite koncentracije uzoraka i test traka koriste se za izračun za razvoj boje i intenziteta boja)
Da biste dodatno procijenili specifičnost MR-DCA-e, istraživački tim testirao je mješovite uzorke ne-transgenih životinja i ne-transgene biljaka. Rezultati su pokazali da su samo transgeni uzorci koji sadrže CAMV35-ove i nos imali visoke fluorescentne signale, dok je intenzitet fluorescencije ostalih uzoraka bio blizu onom negativne kontrole. MR-DCA se može koristiti kao specifična platforma za otkrivanje jezgre kiseline.
24 uzorke obrezi testirani su od strane mr-dca. Među njima, 1, 2, 15, 16, 21 i 22 su transgeni kukuruz koji sadrže promotor CAMV35S. 7, 8, 23 i 24 su transgenička riža otporna na bolest koja sadrži nos terminator. 3, 4, 11, 12, 13, 14, 17 i 18 su transgenični soji koji sadrže CAMV35S Promoter i NoS terminator.
(Rezultati ispitivanja 24 uzoraka)
Brza reakcija
Vrijeme reakcije važan je faktor otkrivanja na licu mjesta. Istraživački tim primijetio je da bi fluorescentna signali FAM i HEX-a mogli otkriti fluorescentnim instrumentom kada je vrijeme reakcije bilo 10 minuta. Mira u kombinaciji sa Crispr Reaction-om također je promatrala žutu fluorescenciju nakon 15 minuta.
(Fluorescentni signal u različitim vremenima reakcije mira)
(Razvoj boja test traka u različitim vremenima reakcije Mira i izračunavanje kvantifikacije intenziteta)
Eksperimentalni zaključak
Eksperimentalni rezultati pokazali su da dual Mira ima dobru specifičnost i može precizno dobiti proizvode pojačanja CAMV35-a i br. Sistemi CAS13A i CAS12A reagiraju samostalno bez miješanja jedno u drugo. Test MR-DCA može precizno otkriti 20 primjeraka na niskoj temperaturi od 35 minuta, što ima veliku vrijednost u otkrivanju genetski modificiranih usjeva na terenu.
Informacije o članku
Ime časopisa: "Časopis za napredni istraživački ekspres
Naslov članka: "Razvoj romana CAS13A / CAS12A-posredovani" Jedno-lonac "Dvostruki test za detekcije za genetski modificirane kulture Express
Faktor uticaja: 11.4
Istraživački tim: Wang Xiaofu, Zhejiang akademija poljoprivrednih nauka