Kozice za travu važne su ekonomske vrste u kineskoj industriji slatkovodne akvakulture. Međutim, poslednjih godinaHepatopankreatički microsporidium(EHP), parazit koji zaražava hepatopancharheas za škampi, teško je utjecao na industriju. Budući da trenutno nema efikasnog lijeka ili cjepiva za liječenje ove bolesti, brza i precizna otkrivanje je presudna za sprečavanje njegovog širenja.
A.MAGNIFIED 9. 0 × 1 0 3 puta; B. uvećava 5,0 × 104 puta.
Qiao Yi, Shen Hui, Wan Xihe, Fan Xianping, Jiang GE, Li Hui, Wang Libao, Shi Wenjun, Cheng Jie. Izolacija i morfološko promatranje hepatopankreatičkog mikrosporidija u Litopenaeus Vannamei. Časopis za ribarske nauke u Kini, 2018, 25 (5): 1051-1058. Doi: 10.3724 / sp.j.1118.2018.17430.
Otkrivanje EHP-a prije svega oslanja se na molekularne metode biologije, a PCR tehnologija je najčešća. Međutim, dok PCR nudi visoku osjetljivost, potrebna je skupa PCR oprema i specijalizirano laboratorijsko okruženje, što ga čini neprikladnim za polje. Da bi se riješio ovaj problem, istraživački tim razvio je dvije metode brzog otkrivanja na osnovu Mira tehnologije. Ove metode nude visoku osjetljivost, brz odgovor i jednostavan rad, omogućavajući efikasno i brzo otkrivanje EHP-a u škampi na licu mjesta bez potrebe za složenom laboratorijskom opremom, čime ispunjavaju jaz u trenutnim metodama otkrivanja.
Pojačani reagensi koji se koriste u studiji:
- DNA izotermalni brzi komplet za pojačavanje (osnovno)
- DNK izotermalni komplet za brzo pojačavanje (koloidni zlatni trak)
Mira Technology je multi-enzimska izotermalna metoda pojačane nukleinske kiseline. Njegov osnovni princip uključuje koordiniranu radnju višestrukih funkcionalnih proteina na ambijentu okoline za postizanje brzog pojačanja nukleinske kiseline, omogućavajući istinski prijenosno otkrivanje nukleinske kiseline na licu mjesta.
Metode istraživanja
Vađenje uzorka
Istraživački tim prikupio je i zaražene i zdrave uzorke škampi od tri farme škampi u provinciji Liaoning, izdvajajući DNK iz hepatopanskežara škara.
Dizajn temeljnog premaza
Tri seta mira temeljnih prajna dizajnirani su ciljajući S8 Serin Protein gena EHP-a (Genbank Pristupni broj: 182063.). Ovaj gen ima jedinstvene aktivne stranice, osiguravajući specifičnost otkrivanja.
Mira-Age i Mira-LFD detekcija
(A) Optimizirana temperatura reakcije RPA-age. M: DL 500 marker; N: negativna kontrola; Siršišta 1-5: 25 stepen, 30 stepeni, 37 stepeni, 39 stepeni i 42 stepena.
(B) optimizirana vremena reakcije RPA-age. M: DL 500 marker; N: negativna kontrola; 1: 10 min; 2: 20 min; 3: 30 min; 4: 40 min.
(C) Optimizirani temperature reakcije RPA-LFD-a. N: negativna kontrola; 1: 25 stepeni; 2: 30 stepeni; 3: 37 stepen; 4: 39 stepeni; 5: 42 stepen.
(D) Optimizirana vremena reakcije RPA-LFD-a. N: negativna kontrola; 1: 5 min; 2: 10 min; 3: 20 min.
Dvije metode otkrivanja mira, mira-dob (elektroforeza agaroze (agarozna gel) i Mira-LFD (koloidni zlatni bočni protok Imunoasay) korišteni su za otkrivanje EHP-a. Istraživački tim optimizirao je reakcijske temperature i vremena po eksperimentiranju. Mira-Age pojačala je ciljnu DNK za 30 minuta u 37 stepeni, dok je Mira-LFD završio pojačanje u samo 10 minuta u 37 stepeni, a rezultati mogu biti čitljivi u roku od 5 minuta.
Eksperimentalni rezultati
Specifičnost i osjetljivost
(A) Specifičnost detekcije RPA-a. M: DL 1000 marker; P: Nosema Bombycis; 1: EHP; 2: Encefalitozoon; 3: Microsporidia; 4: Virus bijelog spot sindroma; 6: nenormalno; N: negativna kontrola.
(B) Specifičnost otkrivanja RPA-LFD-a. P: Nosema Bombycis; N: negativna kontrola; 1: EHP; 2: Encefalitozoon; 3: Microsporidia; 4: Virus bijelog spot sindroma; 6: nenormalno.
(C) osjetljivost RPA-a-a s gradijentnim razrjeđivanjima rekombinantnih plazmida. M: DL 500 marker; N: negativna kontrola; 1: 4,7 × 10 ^ 5 Kopije / μl; 2: 4,7 × 10 ^ 4 kopije / μl; 3: 4,7 × 10 ^ 3 kopije / μl; 4: 4,7 × 10 ^ 2 kopije / μl; 5: 4,7 Kopies / μl; 6: 4,7 Kopije / μl.
(D) osjetljivost RPA-LFD-a s gradijentnim razrjeđivanjem rekombinantnih plazmida. N: negativna kontrola; 1: 4,7 × 10 ^ 5 Kopije / μl; 2: 4,7 × 10 ^ 4 kopije / μl; 3: 4,7 × 10 ^ 3 kopije / μl; 4: 4,7 × 10 ^ 2 kopije / μl; 5: 4,7 Kopies / μl; i 6: 4,7 primjeraka / μl.
Eksperimenti su pokazali da Mira tehnologija ima visoku specifičnost, tačno otkrivanje EHP-a bez reakcije na druge patogene. U pogledu osjetljivosti obje su metode imale ograničenje otkrivanja od 4,7 primjeraka / μl, znatno veće od osjetljivosti tradicionalnog PCR-a.
Ispitivanje kliničkog uzoraka
Rezultati sa testiranja 30 kliničkih uzoraka pokazali su da su Mira-Age i Mira-LFD imali stopu pozitivnosti od 70%, nešto niže od 80% QPCR-a, ali znatno viši od tradicionalnog PCR-a 56,7%.
Izgledi za prijavu
Metode otkrivanja na bazi Mira omogućavaju brzo pojačavanje ciljanih gena na stalnim temperaturama. Konkretno, Mira-LFD metoda može dostaviti rezultate u samo 10 minuta bez potrebe za složenom laboratorijskom opremom, što ga čini idealnim za upotrebu na licu mjesta u farmama škampi. Visoka osjetljivost i specifičnost ove tehnologije čine ga efikasnim alatom za rano otkrivanje i kontrolu EHP-a, čime se štiti zdravlje i razvoj industrije poljoprivrede trave.
Među tim metodama, koloidni zlatni bočni protok Imunoasay (Mira-LFD) posebno je prikladan za prijave na licu mjesta zbog svoje jednostavnosti i intuitivnih rezultata. Poljoprivrednici za škampi mogu brzo otkriti i reagirati na EHP infekcije, poboljšati sposobnost kontrole bolesti, značajno pojačati poljoprivrednu efikasnost i smanjenje ekonomskih gubitaka.