Vidljivo i brzo otkrivanje mačjeg chaphamaparvovirusa korištenjem multienzimske izotermne brze amplifikacije i testa bočnog protoka
Journal:Frontiers in Cellular and Infection Microbiology
Faktor uticaja:4.6
Mačji chaphamaparvovirus(FeChPV)je novi parvovirus, koji je prvi put otkriven kod mačaka s proljevom u Kanadi 2019. Njegova patogenost i molekularne karakteristike ostaju nejasne, a pokazuje i domaćinsku i genetsku raznolikost, što zahtijeva dalja epidemiološka istraživanja. Trenutno ne postoji standardizirana metoda za detekciju FeChPV.
Multienzimska izotermna metoda brze amplifikacije-metoda bočnog protoka (MIRA-LFD)uspješno se koristi za otkrivanje različitih virusa, nudeći prednosti kao što su brzina, jednostavnost i bez potrebe za preciznim instrumentima. Istraživački tim je uspostavio MIRA-LFD metodu pogodnu za FeChPV za rješavanje izazova u kliničkoj detekciji. Bez oslanjanja na precizne instrumente,MIRA-LFD metoda je završila detekciju FeChPV na 37 stepeni u roku od 20 minuta i nije pokazala unakrsnu-reaktivnost s drugim virusima. Granica detekcije bila je 32,3 kopije/μL,10 puta veća od PCR metode. Nadalje, MIRA-LFD metoda je otkrila 29 FeChPV-pozitivnih uzoraka među 417 mačaka s dijarejom, sa stopom pozitivnosti nešto većom od one kod gniježđene PCR metode. Ovi rezultati ukazuju da je uspostavljena MIRA-LFD metoda za otkrivanje FeChPV efikasna, ekonomična, pouzdana i jednostavna metoda, koja doprinosi ranoj prevenciji i kontroli infekcije FeChPV.
1. Eksperimentalne metode
Klinički uzorci:Uzorci rektalnih briseva koji su korišteni u ovoj studiji prikupljeni su od 632 mačke (uključujući 417 s proljevom i 115 zdravih mačaka) i 474 psa (uključujući 342 s proljevom i 132 zdrava psa) u veterinarskim klinikama u Guangdongu, Henan, između Anhui, pokrajine Ingoi i Monji, pokrajine Zhe. 2022. i 2024. godine.
Amplifikacija nukleinske kiseline:Ekstrahovana DNK nukleinska kiselina dodata je u MIRA sistem. Rekombinaza i prajmeri formirali su kompleks; uz pomoć pomoćnih proteina i jednolančanih -vezujućih proteina, napali su dvolančani DNK šablon. Prajmeri su se vezali za homologne komplementarne regije kako bi formirali regiju petlje D-, dok se rekombinaza rastavljala iz kompleksa. Polimeraza se vezala za 3' kraj prajmera i pokrenula sintezu DNK, eksponencijalno pojačavajući ciljni region na šablonu. Ovaj proces se odvijao brzo i efikasno, čime se postiže ultra-brzo pojačanje ciljanog fragmenta za samo 15 minuta.
Razvoj boje test trake:Proizvod amplifikacije nukleinske kiseline razrijeđen je 1:10, nanese se na test traku, a rezultati su očitani nakon 5 minuta.
Cijeli proces od amplifikacije nukleinske kiseline do razvoja boje test trake trajao je samo 20 minuta.
U eksperimentu su korišteni-budući biološki proizvodi:
U studiji su pregledana četiri dizajnirana seta specifičnih kombinacija prajmera-sonde. Za prezentaciju rezultata korištene su i elektroforeza u agaroznom gelu i test trake za nukleinske kiseline. Sve četiri kombinacije prajmera-sonde mogle bi otkriti virus FeChPV. Prema rezultatima elektroforeze u agaroznom gelu, kombinacija FeChPV-4 pokazala je najsjajniju ciljnu traku, pa je ova kombinacija odabrana za naknadno testiranje.
Prema rezultatima elektroforeze u agaroznom gelu, amplifikacija u trajanju od 5, 10, 15 i 20 minuta je dala ciljnu traku. Intenzitet ciljne trake dostigao je vrhunac nakon 15 minuta amplifikacije, postavljajući 15 minuta kao optimalno vrijeme reakcije za ovaj test. Amplifikacija na 36 stepeni, 37 stepeni, 38 stepeni, 39 stepeni i 40 stepeni sve je dalo ciljnu traku, pri čemu je najsjajnija traka primećena na 39 stepeni, postavljajući 39 stepeni kao optimalnu temperaturu reakcije za ovaj test.
(Slika A: 1: Pojačanje 5 min; 2: Pojačanje 10 min; 3: Pojačanje 15 min; 4: Pojačanje 20 min) (Slika B: 1: Pojačanje 36 stepeni; 2: Pojačanje 37 stepeni; 3: Pojačanje 38 stepeni; 4: Pojačanje 40 stepeni; 4: Pojačanje 4 stepena; 5 stepeni
2. Performanse detekcije
Osjetljivost:
(Slika A: MIRA rezultati predstavljeni pomoću elektroforeze u agaroznom gelu)
(Slika B: Ugniježđeni PCR rezultati predstavljeni pomoću elektroforeze u agaroznom gelu)
(Slika C: MIRA rezultati predstavljeni pomoću test traka za nukleinske kiseline)
Uzorci su podvrgnuti 10-strukim serijskim razblaženjima počevši od 3,23×10⁶ kopija/μL. Nested PCR sa elektroforezom u agaroznom gelu mogao je stabilno detektovati 3,23×10² kopija/μL; MIRA sa elektroforezom u agaroznom gelu i MIRA sa test trakama za nukleinske kiseline mogu stabilno detektovati 3,23×10¹ kopija/μL.
MIRA metoda je pokazala dosljednu osjetljivost koristeći dva različita formata prezentacije rezultata, a osjetljivost MIRA metode je bila superiornija od one kod ugniježđenog PCR-a.
Specifičnost:
(1: FeChPV, mačji chaphamaparvovirus; 2: FPV, virus mačje panleukopenije; 3: FeAstV, mačji astrovirus; 4: FBoV, mačji bokavirus; 5: CachaV, pseći čaparvovirus; 6: negativna kontrola)
Novouspostavljena MIRA-LFD metoda je otkrila samo FeChPV i nije pokazala unakrsnu-reaktivnost s drugim referentnim virusima, što ukazuje na dobru specifičnost.
3. Sažetak studije
Ovom studijom ustanovljena je MIRA-LFD metoda za detekciju FeChPV bez potrebe za-instrumenata visoke preciznosti. Kao efikasna, ekonomična i pouzdana metoda detekcije sa visokom osjetljivošću i specifičnošću, MIRA-LFD metoda je pogodnija za kliničko otkrivanje, pružajući tehničku podršku za ranu prevenciju i kontrolu infekcije FeChPV.
4.AMP-BUDUĆA BIOTEHNIKA
MIRA multienzimska izotermna brza amplifikacija nukleinske kiseline je tehnologija koja zaista omogućava brzo otkrivanje-na licu mjesta.
MIRA tehnologija je zasnovana na mehanizmu popravke rekombinacije in vivo gena, oslanjajući se na sinergističko djelovanje višestrukih funkcionalnih proteina na sobnoj temperaturi kako bi se postigla brza (5-20 min), osjetljiva, specifična i sigurna amplifikacija nukleinskih kiselina na sobnoj temperaturi (25 stepeni –45 stepeni). Zbog izotermne prirode MIRA tehnologije, ima niske zahtjeve za opremom i jednostavan rad. Kroz minijaturne prijenosne uređaje, može se primijeniti u testiranju na prvoj liniji u različitim scenarijima primjene, donoseći brzo i precizno testiranje nukleinskih kiselina u postavke kao što su POCT, kućno testiranje, poljoprivredna polja i-provođenje zakona na licu mjesta. Zasnovano na MIRA tehnologiji, Amp-future Biotech je razvio niz proizvoda za brzo testiranje na licu mjesta, uključujući agense za brzo oslobađanje nukleinske kiseline, izotermne reagense za brzo amplifikaciju nukleinske kiseline, test trake za koloidno zlato i minijaturiziranu prijenosnu opremu, stvarajući cjelokupno rješenje za{11}brzo molekularno testiranje na lokaciji. Nadalje, MIRA tehnologija Amp-future nudi prednosti primjene u kombinaciji sa CRISPR tehnologijom, NGS, SNP, mikrofluidikom i još mnogo toga.
Pored niza-proizvoda za brzo testiranje na licu mjesta prikazanih iznad, Amp-future Biotech također nudi:
Reagensi za istraživanje:Pružanje reagensnih sirovina i tehničke podrške za osnovna naučna istraživanja, kao i reference projektne literature.
OEM proizvodnja:Sposoban za neovisnu proizvodnju gotovih proizvoda visoke{0}}čistoće, visoke-aktivnosti tokom cijelog procesa, postižući industrijsku-proizvodnju.
Razvoj po nalogu projekta:Informacije o sekvenci i rezultati analize poravnanja sekvenci, projektni prajmer{0}} dizajn i sinteza sonde, sinteza plazmida projekta i uzorci, projektni izvještaji i rezultati, itd.
Za više informacija, dobrodošli na upit.