Molekularne dijagnostičke tehnologije danas se razvijaju na neviđenom tempu, sa značajnim napretkom u protekle dve godine. Među njima su tehnologije izotermnih pojačanja dobile više pažnje zbog njihove sposobnosti za obavljanje pojačanja bez potrebe za specijaliziranom opremom. Nekoliko poznatih izotermatskih metoda pojačanja postoji, poput lampe, RPA i RAA. Međutim, danas želim uvesti noviju tehnologiju izotermnog pojačanja-mira.
Da bi se osiguralo da svi imaju dosljedno razumijevanje ključnih koncepata, evo nekoliko pojašnjenja objašnjenja:
- Recombinase Polimerifikacija pojačala (RPA): Ovo je rekombinazno-posredovana tehnologija pojačana.
- Amplifikacija sa rekombinase (RAA): Slična metoda pojačanja rekombinaze.
- Izotermna pojačana pojačana petlja (lampica): još jedna izotermna tehnika pojačanja.
- MultienZyme izotermalna brzo pojačala (mira): nova izotermna tehnologija brzog pojačanja.
Brzi sažetak i pojašnjenje:
Mnogi bi se mogli pitati koja je od ovih različitih izotermatskih metoda pojačanja pouzdanija i stabilna. U stvarnosti, svaka tehnologija ima svoje snage i ograničenja. Međutim, ključni faktori uspješnog usvajanja su sposobnost da se izrade izrade, niske troškove i robusne performanse u različitim aplikacijama.
Sada ću ukratko analizirati svaku tehnologiju na osnovu onoga što znam:
Svjetiljka (izotermna pojačala petlje):
Mnogi na terenu znaju da je svjetiljka nastala u Japanu, koju je Dr. Notomi razvio 2000. godine kao nova tehnika pojačanja gena. Trenutno vlasništvo nad ovom tehnologijom pripada japanskoj kompaniji Eiken Chemical Co., Ltd.
Prednosti:
- Visoka osetljivost (2-5 reda veličine veće od tradicionalnih PCR metoda).
- Kratko vrijeme reakcije (reakcije se mogu dovršiti u minutima 30-60).
- Nema potrebe za posebnim instrumentima u kliničkoj upotrebi (mada se preporučuje turnimimetar u stvarnom vremenu tokom razvoja kompleta).
- Jednostavan za rad (bilo da otkrije DNK ili RNA, postupak uključuje miješanje reakcijskog rješenja, enzima i predloška u reakcijskoj cijevi, a zatim u inkubiranju oko 63 stepena u vodenoj kadu ili inkubatoru, s rezultatima koje su promatrane golim okom).
Nedostaci:
- Visoka osetljivost može rezultirati kontaminacijom aerosola nakon što se cijev otvori, što ga čini neprikladnim za upotrebu izvan PCR laboratorija zbog visokog rizika lažnih pozitivnih pozicija.
- Dizajn premaza je izazovan, što ga čini neprikladnim za neke bolesti, posebno one uzrokovane virusima s nekoliko uobičajenih niza.
- Njegova je aplikacija relativno ograničena.
RPA i RAA izotermne tehnologije pojačanja:
Ove dvije metode su u velikoj mjeri homolog, s glavnom razlikom koja se koristi izvor rekombinaze koja se koristi.
- RPA rekombinaza dolazi iz bakteriofara T4.
- Raa je rekombinaza izvedena iz bakterija ili gljivica.
Ključne točke principa rada:
1 U prisustvu ATP-a, rekombinaza se veže za temeljne temeljne temeljne temeljne temeljne temeljne kompleks proteinskih nukleinskih kiselina, koji zatim traži podudaranje ciljanog DNK.
2 Jednom kada primer pronađe odgovarajući DNK predložak, ATP Hydrolys pruža energiju za rekombinazu da napusti temeljni premaz, a DNK polimeraze sintetizira novi DNK pramen.
3. Istovremeno, jedinstveni proteini obvezujući proteini (SSB) vežu se do raseljenog DNK nagrada kako bi se spriječilo reformaciju dvostruke pramenove.
Prednosti:
- Reakcija RPA / RAA vrlo je brza, s rezultatima ostvarivim za oko 30 minuta.
- Osjetljivost može dostići 10 primjeraka / μl.
- Nema potrebe za složenom opremom tokom pojačanja.
- Daljnji razvoj metoda zasnovanih na sondi ili koloidni zlatni kromatografije u velikoj mjeri pojednostavljuje tumačenje rezultata, čineći ih dobro prilagođenim za upotrebu u područjima ograničenim ili ekonomski ugroženim resursima.
Nedostaci:
- RPA je tehnologija koju je razvila britanska kompanija Twistdx koja je sada u vlasništvu Abbotta, što rezultira visokim troškovima, dugom ciklusom opskrbe i nedostatak tehničke podrške. To otežava veliku primjenu i masovnu proizvodnju u Kini.
- Raa je čisto domaća tehnologija, ali nedostaje stabilnost u pogledu remetistencije i dosljednosti reagensa proizvoda. Štaviše, proces proizvodnje za funkcionalne enzime treba poboljšanje. Iako je tehnologija na tržištu pet godina na tržištu, još nije široko usvojena zbog problema sa stabilnosti i svestranosti.
- Oba RPA i RAA zahtijevaju temeljni premaza koji su 30-35 bp. Kraći temeljni premazi utječu na specifičnost, osjetljivost i brzinu pojačanja, činim izazovima dizajna temeljnog prava.
Mira (MultienZyme izotermna brzo pojačanost):
Mira je romana izotermna tehnologija pojačanja koja je uvedena sredinom -2019. To je homologno za RPA i RAA.
Iako Mira dijeli sličnosti sa RPA-om i RAA-om u pogledu principa radova, postoje značajne razlike u enzimskom izboru, uzgoju, pročišćavanju i drugim aspektima proizvodnje velikih proizvodnje. Štaviše, tehnički tim koji stoji iza programera Mira, ampfuture, proveo je skoro 11 godina usavršavajući tehnologiju. Sada je u potpunosti opremljen za podršku razvoju gotovih reagensa, prilagođenih razvoja, istraživačkih projekata i drugih prilagodljivih usluga.
Prednosti:
1. Funkcionalni proteini u Mira reagensima se izvode iz različitih enzima, a neki enzimi su podvrgnuti ciljanim izmjenama kako bi se poboljšala efikasnost osnovnog enzimskog sistema, što rezultira sveobuhvatnijim sistemom.
2. Snažna otpornost na smetnje i stabilnost. Mira reagensi prolaze široku optimizaciju u pogledu odabira i koncentracije kofaktora, zajedno sa procesima proizvodnje za sušenje smrzavanja, čineći ih otpornijim na smetnje i stabilnije.
3. Prilagodba i svestranost. Zbog potpune kontrole nad proizvodnjom funkcionalnih proteina i duboko razumijevanje tehnologije, Mira se može prilagoditi različitim aplikacijama, nudeći različite sisteme reagensa i personalizirane usluge prilagođavanja.
4. Vlasnički patenti. Budući da je Mira 100% domaće razvijena, nema rizika od povrede patenta tokom razvoja proizvoda. To mira daje konkurentsku prednost i na domaćem i međunarodnom tržištu.
5. Uspostavljen je kompletan proizvodni protokol koji omogućava stabilnu proizvodnju velikih razmjera.
Nedostaci:
1. Priznavanje na tržištu je i dalje nisko, a potrebno je više podataka i referenci sa različitih polja (poput pozitivnih stopa u različitim područjima) kako bi se dobilo šire prihvaćanje.
2. Dizajn temeljnog premaza i dalje slijedi karakteristike RPA ili RAA-e, koji zahtijevaju duži temeljni premaz ili sonde, što ne može olakšati brzi prekidač za trenutne PCR korisnike.