Podesiva kontrola aktivnosti Cas12 promovira univerzalnu i brzu detekciju nukleinske kiseline u jednom loncu
Izdavač: Univerzitet nauke i tehnologije Kine
Časopis: Nature Communications
Faktor uticaja: 14.7
Koristeći MIRA tehnologiju, razvijena je univerzalna-metoda detekcije fluorescentne nukleinske kiseline u jednom loncu (ANKETA) zasnovana na natrijum heparinu. Studije su pokazale da natrijum heparin može regulisati aktivnost cijepanja Cas12a ometajući proces vezivanja Cas12a-crRNA. Podešavanjem koncentracije natrijum heparina, SURVEY je kompatibilan i sa klasičnim i sa suboptimalnim PAM sekvencama i primjenjiv je na više podtipova Cas12. Ova metoda, sa vremenom detekcije od samo 15-20 minuta, postiže osjetljivost i specifičnost od preko 95% za otkrivanje pseudovirusa majmunskih boginja, virusa influence A i SARS-CoV-2. Niska je-cijena i pruža novu metodu otkrivanja na licu mjesta za dijagnostiku na terenu i praćenje okoliša, rješavajući tešku ravnotežu između osjetljivosti i specifičnosti u tradicionalnoj CRISPR dijagnostici.
1. Studija o mehanizmu djelovanja heparin natrijuma
A fluorescent probe was added to the Cas12a-crRNA system containing 10nM target DNA, and a rapid and significant fluorescent signal was observed without the addition of sodium heparin. When 0.2ug/ml sodium heparin was added, the fluorescent signal was similar to that of the control group, indicating that sodium heparin greatly inhibited the trans-cleavage activity of Cas12a. 0.2ug/mL of sodium heparin is the minimum inhibitory concentration. As the concentration of sodium heparin increases from 0.2ug/mL to 0.5ug/mL, the cis-cleavage activity of Cas12a is gradually inhibited, and at 0.5ug/mL, the trans-cleavage activity is almost completely inhibited. Studies on the mechanism of action of sodium heparin have shown that the negatively charged groups of sodium heparin interfere with the correct binding of crRNA to Cas12a, and can affect the formation of the crRNACas12a binary complex.
- MIRA-Cas12a otkrivanje jedne{{2} posude
Nakon potvrđivanja mehanizma djelovanja natrijum heparina, rad je istraživao strategiju detekcije u jednom{0}u loncu (MIRA-Cas12a), kombinujući MIRA amplifikaciju i Cas12a-posredovanu detekciju fluorescencije u jednoj cijevi.
U odsustvu natrijum heparina, kombinacija MIRA-Cas12a nije proizvela značajan fluorescentni signal u rasponu koncentracije ciljnog gena od 0,1aM do 10fM. Pri 40 µg/mL natrijum heparina, uočen je značajan signal fluorescencije u rasponu ciljne koncentracije od 1aM (≈0,6 kopija/μL, zapremina=30μL) do 10fM (≈6,000 kopija/μL, zapremina=30} μL, zapremina=30} μL), što pokazuje poboljšanje u odnosu na 0 puta do 0 puta. sistem bez natrijum heparina.
Koncentracija šablona virusa majmunskih boginja bila je 10 fM, a Cas12a-crRNA (100 nM) je korištena za detekciju ciljnih gena f31 i b6r. Reakcija amplifikacije je završena na 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16 i 20 minuta, a sadržaj produkta MIRA amplifikacije u različito vrijeme analiziran je na agaroznim gelovima. Dobijeni proizvodi su zatim analizirani na agaroznim gelovima pod tri različite postavke: MIRA-heparin natrijum bez Cas12a, MIRA-Cas12a bez heparin natrijuma i MIRA-Cas12a sa heparin natrijumom. Rezultati su pokazali da je u odsustvu heparina natrijuma, amplifikacija nukleinske kiseline bila otežana zbog visoke cis{23}}aktivnosti cijepanja Cas12a. Međutim, dodavanje heparin natrijuma značajno je povećalo amplifikaciju nukleinske kiseline zbog smanjenja cis{27}aktivnosti cijepanja Cas12a.
Članak pokazuje da se univerzalna-metoda fluorescentne detekcije nukleinske kiseline u jednom loncu (ANKETA) zasnovana na natrijum heparinu može postići korištenjem klasičnih PAM i suboptimalnih PAM sekvenci. Osim toga, pored LbCas12a, AsCas12a i AapCas12b se također široko koriste u CRISPR-Dx metodama. U sistemu koji koristi MIRA-AsCas12a, fluorescencija je uočena samo u prisustvu 40 ug/mL natrijum heparina, što ukazuje da može otkriti 1fM gena f31 i b6r. U nedostatku natrijum heparina, MIRA-AapCas12b može otkriti 1 gen f31 i b6r. Primjena 20 ug/mL natrijum heparina ne samo da je ubrzala stopu detekcije MIRA-AapCas12b, već je i pojačala intenzitet fluorescencije. Ovi nalazi ukazuju na to da je metoda u jednom loncu razvijena korištenjem doziranja natrijum heparina također primjenjiva na druge podtipove Cas12.
